Para determinar la estructura 3D de una proteína, primero necesita un cristal puro de la misma. El método de la gota pendiente utiliza una gota de solución que contiene proteína que cuelga de un cubreobjetos. Debajo de esta colgando gota se encuentra un depósito con una concentración de sal mayor que la de la caída. Con el tiempo, el vapor de agua sale de la gota y termina en el depósito, haciendo que la proteína a la cristalización. Cada proteína requiere diferentes condiciones (tales como la concentración de sal y pH), y con frecuencia de ensayo y error ofrece la única manera de encontrar las condiciones adecuadas.
PREPARAR CUELGA
Lo que necesita
Bata de laboratorio, guantes y protección para los ojos
Micropipeta con puntas de pipeta
Solución 1 molar de cloruro de sodio en tampón de acetato 0,05 molar, pH 4,7
2 ml tubos Eppendorf (o similar)
Centrifugar
Placa de 24 pocillos
Grasa de vacío en la jeringa
Siliconized cubreobjetos
El aire comprimido
Pinzas
Clay (por ejemplo, plastilina o similar)
50 mg / ml de lisozima en solución 0,05 molar de tampón de acetato, pH 4,7
Ponga en marcha el laboratorio (capa, guantes y protección para los ojos).
Utilice una micropipeta para añadir 1,1 ml de cloruro de sodio (sal) y una solución de tampón de acetato en un tubo Eppendorf.
Centrifugar el tubo Eppendorf cerrado con la solución de sal en su interior durante unos cinco minutos a 13.000 rpm. Recuerde que debe equilibrar la centrífuga mediante la colocación de otro tubo Eppendorf que contiene 1,1 ml de agua a través de y opuesto al tubo de solución salina.
Añadir 1 ml de la solución de sal a un pocillo en una placa de 24 pocillos.
Usar una jeringa lleno de grasa para colocar una capa fina de grasa alrededor del borde de este pozo. Tenga cuidado de no agregar demasiado poco o demasiado. Si se añade demasiada grasa, la grasa se escurra dentro del pozo y posiblemente arruinar su experimento. Si usa muy poco, el pozo no será hermético y el experimento no funciona. Trate de que solo la grasa suficiente que el cubreobjetos y la grasa forman un sello hermético en el futuro.
Enrolle la arcilla con sus manos para hacer cuatro pequeñas bolas, y los empuja hacia las cuatro esquinas de la placa de 24 pocillos. Ellos actuarán como soportes para asegurar la cubierta de la placa no entra en contacto con el cubreobjetos.
Utilice aire comprimido para soplar el polvo fuera del cubreobjetos. Mantenga el cubreobjetos con un par de pinzas limpias.
Aspirar 4 microlitros de la solución de lisozima con su micropipeta, y añadir esta solución al centro del cubreobjetos. Cambiar las puntas de pipeta y añadir 4 microlitros de la solución de sal. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, chupando en el líquido a continuación expulsarlo, para mezclar la solución salina con la solución de lisozima. Tenga cuidado al mezclar los dos sin dispersar el líquido en todo el cubreobjetos.
Gire el cubreobjetos sobre rápidamente para que el líquido no se salga, y la planta de lleno encima del pozo. Tener cuidado para presionar suavemente sobre el mismo por lo que forma un sello hermético con la grasa todo alrededor de los bordes del pozo.
Empuje la cubierta de la placa de 24 pocillos sobre las bolas de arcilla, y dejar el plato en un lugar fresco.
Bueno!
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